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Analyseverfahren im Detail

Mikrobiologische Nachweismethoden

Grundlage aller mikrobiologischen Untersuchungen ist die Kultivierung vermehrungsfähiger Organismen. Das Probenmaterial wird auf ein Nährmedium aufgebracht, wobei enthaltene Schimmelsporen oder Konidien zu Kolonien heranwachsen. Schnellwachsende Schimmel können dabei aber, insbesondere bei unsachgemäßer Handhabung, langsamer wachsende überwuchern, die dadurch nicht mehr erkennbar sein können.

Eine erste Aussage kann auf Grund von spezifischen Eigenschaften wie Osmophilie, Temperaturoptimum oder spezifischen Wachstumsfaktoren gemacht werden.

Nach einer Wartezeit von 2 Tagen bis 2 Wochen verfärben sich die Schimmel oft. Aussehen und Färbung können erste Anhaltspunkte geben, die Interpretation erfordert aber spezialisierte Fachkenntnis und Erfahrung, denn eine schwarze, weiße oder grüne Färbung tritt bei vielen Schimmeln auf. Die Färbung ist auf die Bildung von Sporen zurückzuführen. Sporen sind die Einheiten, durch die sich Schimmel vermehren und können in etwa als Analoga zu Samenkörnern gedacht werden. Anders als Samen sind Sporen aber viel simpler in Struktur und Funktion. Sporen werden in einer pilzspezifischen Weise gebildet und unterscheiden sich in ihren Charakteristika wie Form, Größe oder Farbe. Sie sind deshalb das wichtigste Kriterium zur Differenzierung von Schimmeln. Dafür werden die gewachsenen Schimmelkolonien unter einem Mikroskop betrachtet.

Bei geeigneter Verdünnung kann man annehmen, dass sich aus einer Schimmelspore auch eine Kolonie entwickelt, was eine grobe Quantifizierung in Kolonien bildende Einheiten (KbE) erlaubt (KbE / g Staub oder bei einer Abklatschprobe KbE/cm²). Liegen die Sporen allerdings in Aggregaten (zusammengeklumpt) vor, wächst davon pro Aggregat auch nur eine Kolonie.

Große Bedeutung kommt bei der mikrobiologischen, wie bei jeder Schimmelanalytik, dem Probenmaterial zu. Typisch sind z. B. Staub, Filter, Tapete, Putz und Holz, aber auch Wasser aus einer Klimaanlage, Tropfenabscheider, Abschlämmvorrichtung oder Rückkühltürmen. Jedes Probenmaterial erfordert eine spezifische Vorbereitung.
Liegt sichtbarer Schimmel vor, kann die Bestimmung auch durch eine direkte mikroskopische Betrachtung der Materialprobe, die direkte Kultivierung einer Abklatschprobe oder die mikroskopische Untersuchung eines Klebefilmabriss-Präparates erfolgen.


Zytotoxizitätstest (Zellkulturtest)

Allgemeine Nachweismethode für potentiell gesundheitsschädliche Stoffe in Materialien, Staub oder Luft. Zellschädigende Substanzen werden erkannt, können jedoch noch nicht genau spezifiziert werden. Diese Analyse eignet sich besonders, um eine potentielle Gefährdung schnell beurteilen zu können. Weitere Informationen finden Sie hier.

Bei der Beantwortung der hygienischen Qualität von Lebens- und Futtermitteln sowie von Umweltproben spielt nicht nur die mögliche Belastung mit pathogenen und / oder saprobiotischen Mikroorganismen eine Rolle, sondern auch die Kontamination sowohl mit toxischen Stoffwechselprodukten mikrobieller Herkunft (bakterielle Toxine und die von Schimmelpilzen gebildeten Mykotoxine) als auch die Belastung mit Xenobiotika. Im Unterschied zu physikalisch-chemischen und immunchemischen Methoden, die den Nachweis und die Identifizierung einzelner Toxine in Nahrungsmitteln erlauben, können mit Hilfe von biologischen Testverfahren Hinweise zur Toxizität als Summenparameter erfasst werden. Der Einsatz von Bioassays ist insbesondere dann sinnvoll, wenn mehrere Toxine in einer Probe erwartet werden können. Für diesen Zweck wurde in den letzten Jahren ein Bioassay auf Zellkulturbasis entwickelt und für die Überprüfung der hygienischen Qualität von Nahrungsmitteln, Futtermitteln sowie Umweltproben eingesetzt. Grundlage des Testes ist die Spaltung von gelbgefärbten Tetrazoliumsalzen (MTT) zu violetten Formazanen durch in Mikrotiterplatten kultivierbare Zellinien. Jede Schädigung dieser Zielzellen durch zytotoxische Substanzen oder Rückstände in Rohextrakten von Probenmaterialien reduziert diese Spaltungsaktivität und erlaubt eine objektive Aussage über die mögliche Belastung mit
zytotoxischen Rückständen im Vergleich zu Kontrollproben. Die Anwendungsbereiche des Bioassays umfassen neben der Testung von Standardsubstanzen und Schimmelpilzisolaten Lebens- und Futtermittel sowie unterschiedlichste Umweltproben.

(Gareis, M. und R. Rotheneder (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 159, 1 - 6)

Zytotoxizität von Mykotoxinen im MTT-Zellkulturtest mit SK-Zielzellen

Mykotoxin IC50

µg/ml µM
Roridin A 0,0018 0,0033
Verrucarin A 0,0070 0,0139
Satratoxin G 0,0081 0,0149
Satratoxin H 0,0183 0,035
T2-Toxin 0,0373 0,080
Gliotoxin 0,34 1,05
Nivalenol 2,08 6,66
Patulin 4,23 27,45
Chaetocin 11,56 16,61
Fumagillin 12,50 27,26
Deoxynivalenol (DON) 17,73 59,84
Ochratoxin A 15,31 37,91
Citrinin 25,00 99,88
Monorden 25,00 68,53
Penicillinsäure 25,00 146,89
Tenuazonsäure 40,62 178,16
Alternariol 116,67 451,86
Beauvericin 200,00 255,1
L-DON > 200,00 > 680,27
Mycophenolsäure 200,00 624,41
Penitrem A 200,00 315,36
Sterigmatocystin > 200,00 > 616,71
X-DON 200,00 675,68
Roquefortine C 250,00 641,85
Cyclopiazonsäure 400,00 1190,12
IC50 (inhibitory concentration 50): Toxinkonzentration, die die MTT-Spaltungsaktivität auf 50 % der Kontrollwerte reduziert (Gareis, M. und R. Rothender (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 159, 1 – 6)


Neu: Real-Time PCR (Polymerase chain reaction)

Jede Spezies ist durch ihr Erbgut eindeutig charakterisiert, egal welche Struktur sie auf Grund von Umwelteinflüssen annimmt. So kann man einen Menschen anhand seiner DNA eindeutig als Menschen und als Kind seiner Eltern von allen anderen Lebewesen identifizieren, egal welche Hautfarbe, Gestalt oder Alter er hat. Daher spielen molekularbiologische Nachweisverfahren immer dort eine entscheidende Rolle, wo es gilt, eine Lebensform eindeutig zu identifizieren, zum Beispiel in der Gerichtsmedizin, zur Bestimmung von Erbkrankheiten in Mumien, beim Nachweis bestimmter tierischer Bestandteile in Nahrungsmitteln oder von genetisch veränderten Pflanzen.
Unter den molekularbiologischen Methoden nimmt die PCR (Polymerase-Chain= Ketten-Reaktion) einen vorrangigen Platz ein. Das Verfahren beruht auf einer selektiven Vervielfältigung von DNA-Bruchstücken und wurde ursprünglich von Karry Mullis entwickelt, der dafür 1993 den Nobelpreis erhielt. Seither wurden vielfältige Variationen erforscht, die nicht nur den sehr spezifischen Nachweis von charakteristischen Erbgut-Sequenzen erlauben, sondern auch in vielen Fällen eine Quantifizierung möglich machen (Real Time PCR).

Diese Vielseitigkeit der PCR lässt sich seit Kurzem auch zum schnellen und empfindlichen Nachweis von Schimmelpilzen nutzen. Mittels PCR können unterschiedliche Spezies trotz ihres manchmal sehr ähnlichen Aussehens, die sich zudem in Abhängigkeit von Umwelteinflüssen ausprägen kann, eindeutig identifiziert werden. Da die PCR unabhängig von Stoffwechselprozessen operiert, haben Faktoren wie Nahrungsangebot, Temperatur oder Feuchte keinen Einfluss auf das Ergebnis. Die PCR erfasst auch abgestorbene oder solche Schimmel, die nicht mehr oder nur sehr eingeschränkt wachsen. Diese Schimmel sind mikrobiologisch überhaupt nicht oder nur mit großem Aufwand nachzuweisen, weil sie von sich schneller vermehrenden Organismen überwachsen werden. Darüber hinaus wird durch PCR die Quantifizierung (Mengenbestimmung) des gesuchten Schimmels direkt in einer Probe möglich.

Durch Variation der PCR-Kriterien lassen sich u.U. auch bestimmte Gruppen von Schimmeln mit gemeinsamen Eigenschaften, z.B. Trichothecenbildner, nachweisen.

Die Grenzen der Methode liegen darin, dass nur diejenigen Schimmel identifiziert werden können, nach denen auch gezielt gesucht wird. Die PCR gibt also keine Auskunft über das gesamte Schimmelspektrum in einer Probe, sondern nur darüber, ob und ggf. in welcher Menge die gesuchte Spezies (Gruppe) in der Probe vorhanden ist.


Was sind die Vorteile der Real-Time-PCR Methode?

PCR ist eine schnelle, spezifische und empfindliche Methode, um selektiv
ein bestimmtes DNS-Fragment (DNS: Desoxyribonucleinsäure, Erbsubstanz),
das nur in einem bestimmten Schimmelpilz vorkommt, zu vervielfältigen.
Das Verfahren nutzt ein zelleigenes Enzym, die DNS-Polymerase, das DNS-Abschnitte kopieren kann, wie das auch bei der Zellteilung im Körper geschieht.
Die Aussagekraft der Ergebnisse ist umfassend und unabhängig von einer subjektiven Beurteilung der Probe, PCR kommt immer zu einem exakten und reproduzierbaren Resultat.


Die Real-Time-PCR-Analyse im Vergleich zur Mikrobiologie:

PCR
kultureller Nachweis
Nachweis lebender und nicht mehr vermehrungsfähiger Sporen und Myzelbestandteile
Erfaßt ausschließlich vermehrungsfähige Sporen
Identifikation sehr spezifisch, auf Gattungs- und Speziesebene möglich, Trichothecenbildner sind als Gruppe erfaßbarIdentifikation erfahrungsabhängig, teilweise nur auf Gattungsebene möglich
keine Kultivierung nötig, keine Verzerrung durch unterschiedliche Wachstumsansprüche
Kultivierung zeitaufwendig, langsamer wachsende Schimmel können von schneller wachsenden überwuchert werden
Sehr spezifisch, man muß sich vorher überlegen, wonach man suchtUnspezifisch, prinzipiell können alle Schimmelpilze erfaßt werden


Hier finden Sie einen Überblick über die von der CENAS AG angebotenen
Analyse-Packages.

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